（1）建立分析检测方法的主要依据
①待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况。准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物，通过预处理将待测物从结合物或缀合物中释放。
选择样品预处理方法时，首先应考虑待测药物的理化性质，如药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等。对于具有亲脂性药物应在适当的pH 值下用溶剂萃取；对于具有强极性或亲水性的药物就应沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等；对于具有挥发性的药物最好选用GC 测定法；对于具有光谱或电化学特性可以选用分析检测方法。考虑到药物的稳定性，若药物对酸碱不稳定则避免使用强酸或强碱性溶剂，若对热不稳定则应避免高温蒸发溶剂。
然后应考虑到药物在生物体内的存在状况。根据药物与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低选择合理的分离萃取方法。比如，药物与蛋白结合较强则不宜直接采用溶剂萃取。根据体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物选择分析检测方法。如果血药浓度较低（尤其有代谢产物共存），那么采用LC-MS、EIA 等分析检测技术将代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定。
最后，也必须考虑到药物在生物体内的生物转化（代谢）途径。
②分析测定的目的与要求。当体内药物分析用于临床治疗药物监测时，则主要考虑有效治疗浓度范围内药物浓度，那么分析方法应该尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定，所以大多采用UV、RIA 或EIA 等。当当体内药物分析用于中毒患者的临床抢救时，因为一般地药物浓度极高，所以分析方法不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度，故大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA 或EIA。
③生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用。一般地，以血浆或血清为分析样品采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术，该方法适用于较为“干净”，可用HPLC 检测的分析样品。用RIA 分析，样品的预处理方法可较为粗放，即经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定。
④在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。
（2）体内药物分析方法建立的步骤
①分析方法的选择
生物样品中的药物浓度是决定分析方法的首要因素。生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少则难以通过增加取样量提高方法灵敏度，所以要通过选择适当的分析方法适应样品分析需求。
②分析方法的建立
在分析方法建立之前需要查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定。初步拟定分析方法后要进行一系列试验工作，从而选择最佳分析条件。同时，验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品。需要注意的是，分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的。
第一步是检测条件的筛选。照拟定的分析方法（不包括生物基质的预处理）测定，用标准物质进行实验，确定最佳分析检测条件（如色谱条件）和检测灵敏度。然后调整检测器（类型、条件）选择合适的色谱柱、流动相及其流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量，从而使各物质具有足够的方法灵敏度，得到良好的色谱参数和适当的保留时间。
第二步是分离条件的筛选。在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，故需要进行空白溶剂试验、空白生物基质试验、模拟生物样品试验、实际生物样品测试。
空白溶剂试验是将待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等，测定响应信号，旨在考察方法的特异性，要求空白值应尽可能小，并能有效校正。
接下来对空白生物基质进行试验，如空白血浆，方法与空白溶剂试验方法类似，目的是考察物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）以及在待测药物（或特定的活性代谢物、内标物质等）的信号附近的有限范围内不应出现内源性物质信号。
模拟生物样品实验就是在空白生物基质中加入待测药物再检测响应信号，旨在考察方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度，药物的萃取回收率等各项技术指标，同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性。
空白生物基质和模拟生物样品试验只是为了确定的分析方法及其条件，还不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定，而且药物在体内可能与内源性物质结合（如血浆蛋白结合物）或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物（或缀合物），所以在确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试，考察代谢产物对药物、内标物质的干扰情况，进一步验证方法的可行性。