转氨酶的辅因子为磷酸吡哆素，通过磷酸吡哆醛（PLP）与磷酸吡哆胺（PMP）的转化，形成希夫碱中间产物，使一个氨基酸转变为α-酮酸，另一个α-酮酸转变为新的氨基酸。当无底物时PLP的醛基与转氨酶的活性中心赖氨酸残基的ε-NH₂结合，希夫碱即醛亚胺。当底物存在是，氨基酸的α-NH₂置换活性中心赖氨酸残基的ε-NH₂，形成氨基酸-PLP希夫碱（即醛亚胺），使氨基酸以非共价键牢固地结合在转氨酶上。