第一维采用等电聚集（isoelectric focusing，IEF）电泳。当把蛋白质加人到含有pH梯度的载体时，如果蛋白质所在位置的pH值与其等电点不同，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷，在外加强电场的作用下，蛋白分子就会分别向正极或负极泳动，直到pH值与其等电点相等的位置，蛋白质不再泳动，而浓缩成狭窄的区带。
第二维采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。蛋白质的电泳迁移率取决于各种蛋白质所带的静电荷、分子量的大小以及形状的不同。SDS-PAGE就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。蛋白质样品经过双向凝胶电泳两次分离后，其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。