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参考答案:

胚胎细胞移植操作程序
(1)卵母细胞的去核。目前常用荧光诱导去核法。荧光引导去核法先用Hoechst33342对卵母细胞染色10~15分钟,然后,在荧光显微镜下确定核的位置后去核。
(2)供体核的准备和移植。胚胎克隆过程中,供体核来自早期胚胎。供体核的准备实质上是把供体胚胎分散成单个卵裂球,每个卵裂球就是一个供体核。取得卵裂球的方法主要是用蛋白酶消化透明带,然后用微管把胚胎分散成单个卵裂球。准备好卵裂球后,用移植微管吸取一个卵裂球,借助显微操作仪沿着去核孔将卵裂球注入卵子的卵黄周隙中,即完成移植过程。
(3)融合。融和方法目前使用电融和法。电融和是将操作后的卵母细胞和卵裂球复合体放入电解质溶液中,在一定强度的电脉冲作用下,使卵裂球与卵子相互融合。在电击过程中,两者的接触要与电场方向垂直。
(4)激活。在胚胎核移植过程中,通常用一定强度的电脉冲作用卵母细胞,造成卵母细胞内外膜结构出现瞬时通道,胞质内的钙离子进入受体核区,激活细胞核,则恢复细胞周期,同时启动胚胎发育。
(5)重构胚的培养。重构胚可体外做短时间培养后,移植到受体内,也可以在中间受体或体外培养发育到桑葚胚或囊胚时,在进行冷冻保存或胚胎移植。
体细胞核移植的操作方法:和胚胎细胞克隆基本相同,主要差别在供体细胞的选择。体细胞克隆的核供体是体外培养传代的体细胞,根据Campell等人提出的方法,体细胞需经过血清饥恶,即细胞培养液中血清浓度由10%降至0.5%,继续培养5d左右,使细胞处于休止的G0期,再移植到去核卵母细胞的卵黄周隙中,经电融和激活后获得克隆胚胎,移植到受体后获得克隆后代。后来细胞不经血清饥恶,可以直接移入去核卵母细胞中生产克隆胚胎,并且已在小鼠和牛上获得成功。

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