问答题X 纠错λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA 文库的高效载体,这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA 被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组,并进行独立复制,这就可以从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。 为了最大限度地提高克隆效率,载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶 XhoI(5’-C十 TCGAG)进行切割,然后在 dTTP 存在的情况下,同 DNA 聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA 同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段寡聚核苷酸的序列是:5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC,它们的 5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用 2μg的7载体和 0.1μg 的 cDNA,构建了一个有 4×10 个克隆的 cDNA 文库。
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λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA 文库的高效载体,这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA 被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组,并进行独立复制,这就可以从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。 为了最大限度地提高克隆效率,载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶 XhoI(5’-C十 TCGAG)进行切割,然后在 dTTP 存在的情况下,同 DNA 聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA 同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段寡聚核苷酸的序列是:5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC,它们的 5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用 2μg的7载体和 0.1μg 的 cDNA,构建了一个有 4×10 个克隆的 cDNA 文库。
在此过程中,载体分子转变成重组体的频率是多少(每对核苷酸的平均分子量 660Da)?问答题
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X染色体的失活是一种独特的发育调控机制,它关闭了整个染色体上的所有基因的表达。在人类 X 染色体中,失活作用涉及到 1.5×108 以上的碱基对和几千个基因。在女性中,两条X染色体中的任何一条失活所造成的X连锁基因的表达与正常男性单个X染色体上基因表达的结果是相同的。虽然失活的机理仍不了解,一般认为失活作用是在染色体的特定区域即 X 失活中心开始的,然后扩散到染色体的其他部分。虽然失活染色体上的大多数基因被关闭了,但少数仍有活性,因此,可以推测 X 的失活作用与 X 连锁基因的表达模式有关。为了验证这种推测,分离了大量的人的 X 染色体基因的 cDNA 并用 Northern 印迹法检查它们的表达。比较了这些基因在 X 染色体正常的男性和女性细胞中的表达、在 X 染色体异常的男性和女性个体中的表达、以及在啮齿动物:人细胞杂交株中的表达,这种杂交株保留了一个失活的人的 X染色体(Xi)或是一个有活性的人 X染色体(Xa)。在四种 cDNA 中,发现了三种表达模式,A、B、C 三种 cDNA示于图 4。
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四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小核(微核)含有细胞染色体的主要拷贝,它参与细胞的性接合,而并不在通常的基因表达中起作用。大核(巨核)含有细胞基因组的“工作”拷贝,由大量基因大小的双链 DNA 片段(微染色体)组成,它们活跃地进行着转录。含有核糖体 RNA基因的微染色体拷贝数很多,可以用梯度离心进行分离。在电子显微镜下检查,每一个核糖体微染色体是一种长为 21kb 的线性结构。进行凝胶电泳时,核糖体微染色体的迁移也是 21kb(图 3 的第一泳道)。但是,如果用限制性内切核酸酶BglⅡ切割微染色体,产生的两个片段(13.4kb 和 3.8kb)的总和不等于 21kb(图3的第二泳道),改用其他的限制性内切核酸酶切割,所产生的限制性片段的总和也都小于 21kb,并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。如果把未经切割的微染色体先进行变性和复性处理,然后再进行凝胶电泳,所得到的双链 DNA片段只有 10.5kb(图 3 第三泳道);与此相似的是,将 BglⅡ切割的微染色体进行变性和复性,电泳后,13.4kb的片段被 6.7kb 的片段所取代 (图 3 第四泳道)。请解释为什么限制性片段的总长度不等于 21kb?为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变?对于核糖体微染色体中的总序列组成你有什么看法?
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用 BamHI切割一重组质粒 DNA 分子并从中分离纯化了两个 DNA片段,一段长400bp,另一段长 900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来,得到如图 1 所示的结果。
于是将这两种片段混合起来,并在连接酶的存在下进行温育,分别在 30 分钟和 8 小时取样进行凝胶电泳分析,令人惊讶的是,连接产物并非是理想中的 1.3kb的重组分子,而是一种复杂的片段模式(图 A)。同时发现随着温育时间的延长,较小片段的浓度逐渐降低,大片段的浓度逐渐增加。如果用 BamHI来切割连接后的混合物,则起始的片段可以重新产生(图 A)。
从凝胶中分离纯化出 1.3kb 的片段,并取出一部分用 BamHI进行切割,以检查它的结构。正如预料的一样,出现了两个原始的带(图 B)。但是用 EcoRI切割另一部分样品,希望能够产生两个 300bp 和一个长度为 700bp 的核苷酸片段,然而,凝胶电泳的结果,令人惊奇(图 B)。
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用 BamHI切割一重组质粒 DNA 分子并从中分离纯化了两个 DNA片段,一段长400bp,另一段长 900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来,得到如图 1 所示的结果。
于是将这两种片段混合起来,并在连接酶的存在下进行温育,分别在 30 分钟和 8 小时取样进行凝胶电泳分析,令人惊讶的是,连接产物并非是理想中的 1.3kb的重组分子,而是一种复杂的片段模式(图 A)。同时发现随着温育时间的延长,较小片段的浓度逐渐降低,大片段的浓度逐渐增加。如果用 BamHI来切割连接后的混合物,则起始的片段可以重新产生(图 A)。
从凝胶中分离纯化出 1.3kb 的片段,并取出一部分用 BamHI进行切割,以检查它的结构。正如预料的一样,出现了两个原始的带(图 B)。但是用 EcoRI切割另一部分样品,希望能够产生两个 300bp 和一个长度为 700bp 的核苷酸片段,然而,凝胶电泳的结果,令人惊奇(图 B)。
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