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λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA 文库的高效载体,这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA 被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组,并进行独立复制,这就可以从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。       为了最大限度地提高克隆效率,载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶 XhoI(5’-C十 TCGAG)进行切割,然后在 dTTP 存在的情况下,同 DNA 聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA 同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段寡聚核苷酸的序列是:5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC,它们的 5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用 2μg的7载体和 0.1μg 的 cDNA,构建了一个有 4×10 个克隆的 cDNA 文库。

参考答案:

2μg中,载体分子的数目是:4.2×1010

因为这些载体分子得到了 4×10 的重组体,所以产生重组体的效率大约是 0.1%。 

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问答题

λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA 文库的高效载体,这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA 被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组,并进行独立复制,这就可以从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。       为了最大限度地提高克隆效率,载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶 XhoI(5’-C十 TCGAG)进行切割,然后在 dTTP 存在的情况下,同 DNA 聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA 同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段寡聚核苷酸的序列是:5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC,它们的 5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用 2μg的7载体和 0.1μg 的 cDNA,构建了一个有 4×10 个克隆的 cDNA 文库。假定载体长为 43kb,cDNA 的平均长度是 lkb,请估计在连接混合物中,载体分子同cDNA 的比例是多少?

参考答案:在连接反应混合物中,载体分子和 cDNA 分子的比例大约是 1:2。在长度上载体大约是 cDNA 的 40 倍(43kb...

问答题

X染色体的失活是一种独特的发育调控机制,它关闭了整个染色体上的所有基因的表达。在人类 X 染色体中,失活作用涉及到 1.5×108 以上的碱基对和几千个基因。在女性中,两条X染色体中的任何一条失活所造成的X连锁基因的表达与正常男性单个X染色体上基因表达的结果是相同的。虽然失活的机理仍不了解,一般认为失活作用是在染色体的特定区域即 X 失活中心开始的,然后扩散到染色体的其他部分。虽然失活染色体上的大多数基因被关闭了,但少数仍有活性,因此,可以推测 X 的失活作用与 X 连锁基因的表达模式有关。为了验证这种推测,分离了大量的人的 X 染色体基因的 cDNA 并用 Northern 印迹法检查它们的表达。比较了这些基因在 X 染色体正常的男性和女性细胞中的表达、在 X 染色体异常的男性和女性个体中的表达、以及在啮齿动物:人细胞杂交株中的表达,这种杂交株保留了一个失活的人的 X染色体(Xi)或是一个有活性的人 X染色体(Xa)。在四种 cDNA 中,发现了三种表达模式,A、B、C 三种 cDNA示于图 4。

指出每一种表达模式中表达的基因是来自于活性染色体、非活性染色体,还是二者都有。哪一种是最普遍的,哪一种是最特殊的?

参考答案:根据基因 A在雄性和雌性中的等量表达以及在杂种细胞中的表达情况看,基因A只在活性的 X染色体上表达。根据基因 B 在杂种...

问答题

四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小核(微核)含有细胞染色体的主要拷贝,它参与细胞的性接合,而并不在通常的基因表达中起作用。大核(巨核)含有细胞基因组的“工作”拷贝,由大量基因大小的双链 DNA 片段(微染色体)组成,它们活跃地进行着转录。含有核糖体 RNA基因的微染色体拷贝数很多,可以用梯度离心进行分离。在电子显微镜下检查,每一个核糖体微染色体是一种长为 21kb 的线性结构。进行凝胶电泳时,核糖体微染色体的迁移也是 21kb(图 3 的第一泳道)。但是,如果用限制性内切核酸酶BglⅡ切割微染色体,产生的两个片段(13.4kb 和 3.8kb)的总和不等于 21kb(图3的第二泳道),改用其他的限制性内切核酸酶切割,所产生的限制性片段的总和也都小于 21kb,并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。如果把未经切割的微染色体先进行变性和复性处理,然后再进行凝胶电泳,所得到的双链 DNA片段只有 10.5kb(图 3 第三泳道);与此相似的是,将 BglⅡ切割的微染色体进行变性和复性,电泳后,13.4kb的片段被 6.7kb 的片段所取代 (图 3 第四泳道)。请解释为什么限制性片段的总长度不等于 21kb?为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变?对于核糖体微染色体中的总序列组成你有什么看法?

参考答案:限制性内切核酸酶片段的长度不会达到 21kb,且电泳的方式也会随变性和复性而变化,这是因为核糖体微染色体是一种反向的二聚...

问答题

用 BamHI切割一重组质粒 DNA 分子并从中分离纯化了两个 DNA片段,一段长400bp,另一段长 900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来,得到如图 1 所示的结果。  
于是将这两种片段混合起来,并在连接酶的存在下进行温育,分别在 30 分钟和 8 小时取样进行凝胶电泳分析,令人惊讶的是,连接产物并非是理想中的 1.3kb的重组分子,而是一种复杂的片段模式(图 A)。同时发现随着温育时间的延长,较小片段的浓度逐渐降低,大片段的浓度逐渐增加。如果用 BamHI来切割连接后的混合物,则起始的片段可以重新产生(图 A)。  
从凝胶中分离纯化出 1.3kb 的片段,并取出一部分用 BamHI进行切割,以检查它的结构。正如预料的一样,出现了两个原始的带(图 B)。但是用 EcoRI切割另一部分样品,希望能够产生两个 300bp 和一个长度为 700bp 的核苷酸片段,然而,凝胶电泳的结果,令人惊奇(图 B)。

为什么用 EcoRI切割纯化的 1.3kb 连接物会产生那么多的片段?

参考答案:由于任意两个 BamHI末端可以连接,甚至同一大小的片段也有几种不同的结构(如图A22.1 中的1.3kb 片段);所以...

问答题

用 BamHI切割一重组质粒 DNA 分子并从中分离纯化了两个 DNA片段,一段长400bp,另一段长 900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来,得到如图 1 所示的结果。  
于是将这两种片段混合起来,并在连接酶的存在下进行温育,分别在 30 分钟和 8 小时取样进行凝胶电泳分析,令人惊讶的是,连接产物并非是理想中的 1.3kb的重组分子,而是一种复杂的片段模式(图 A)。同时发现随着温育时间的延长,较小片段的浓度逐渐降低,大片段的浓度逐渐增加。如果用 BamHI来切割连接后的混合物,则起始的片段可以重新产生(图 A)。  
从凝胶中分离纯化出 1.3kb 的片段,并取出一部分用 BamHI进行切割,以检查它的结构。正如预料的一样,出现了两个原始的带(图 B)。但是用 EcoRI切割另一部分样品,希望能够产生两个 300bp 和一个长度为 700bp 的核苷酸片段,然而,凝胶电泳的结果,令人惊奇(图 B)。

在原始连接混合物中为什么有如此多的带?

参考答案:由于任意两个 BamHI位点都可以连接在一起,产生的连接产物就很复杂。因此, 0.4kb的片段连接在一起可以产生诸如 0...

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参考答案:要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有:(1)细菌的 RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。(2)大...

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参考答案:将140kb 的克隆片段分成一系列更小的片段,以每一个片段作为探针对其他哺乳动物的 DNA进行印迹实...

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种子在储藏过程中发生了某种变化,使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致一个具有抗菌功能的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确,如何使种子重新获得对这种病的抗性?

参考答案:将敏感植株与抗性植株杂交后观察其后代的分离模式,判断功能的缺失与显性是否有关。通过 mRNA 差异显...

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说明 Southern 杂交的原理和方法。

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