影响 DNA连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以 12℃～15℃最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在 DNA的退火问题，但是温度高于 30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高 10～100倍。DNA中有残存的 tRNA 不会抑制 DNA连接酶的活性，但是，如果 NaCl 的浓度高于 150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。 另外反应体系中有 NH⁴⁺离子的存在，对 E．coli DNA连接酶具有激活作用E．coliDNA  连接酶需要 NAD⁺作辅助因子，而 T4DNA连接酶需要 ATP。

应注意Mg²⁺离子浓度和处理时间及温度。

 因为 BAP耐热和耐酚抽提。

S1 核酸酶作图是一种对 RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。