（1）温度：大部分限制性内切酶最适反应温度为37℃，少数酶高于或低于这个温度。
（2）时间：合适，大多为1h，可过夜反应。
（3）溶液体系：要求有稳定的pH环境。标准的缓冲溶液中含有氯化钙、氯化镁或氯化钾、Tris-HCl、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清蛋白质（BSA）和Mg²⁺，具有一定的酸碱值即pH值。
（4）盐离子浓度：不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na⁺）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。Mg²⁺也是限制性内切酶酶切反应所需。
（5）反应体积和甘油浓度：在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。
（6）DNA的纯度和结构：DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。