2D-PAGE原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异而使之分别在等电聚焦（isoelectric  focusing，IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离出来。
应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学研究主要步骤有：
1、在应用2D-PAGE研究差异蛋白质组学问题时首先要获得要进行差异比较的组织，如肿瘤组织与癌旁正常组织，然后裂解组织和细胞，抑制蛋白酶活性，出去非蛋白质的DNA，RNA，脂类等物质，溶解蛋白质，溶解并抽提总蛋白质。
2、将准备好的蛋白质进行2D-PAGE实验，先选择合适的PH范围进行等电聚焦，平衡胶条，再进行第二维的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3、对2D凝胶进行染色处理（可选择各种染色方法），利用软件分析比较成对组织的2D结果，找到上调或下调的蛋白质点。
4、将有差异的蛋白质点切割下来进行质谱分析，质谱谱图通过查询数据库找得蛋白质点对应的蛋白质。5、对于得到的有差异的蛋白质要进一步进行验证，常用的手段包括：WesternBlot，RT-PCR，免疫组织化学等。
利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的优点主要在于：
1、效率高：目前，一块胶板（16cm×20cm）可检测到3000～4000个甚至10000个蛋白斑点。
2、可重复性好：80年代开始采用固定化pH梯度胶的IEF，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，可建立很窄的pH范围（0.05U/cm），对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化pH梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；
3、灵敏度高：SDS-PAGE有垂直板和水平超薄胶电泳两种方法，可分离10～100kD分子量的蛋白质；银染色法可检测到4ng蛋白，同位素标记法最灵敏，可测定20ppm的标记蛋白。
利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的缺点主要在于：
1、对盐，DNA等杂质高度敏感。
2、对于溶解度低的输水性蛋白质，酸性，碱性蛋白质效果不好。
3、对PH和MW的范围有所限制。
4、耗时，无法自动化。