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定义:PCR技术又称聚合酶链式反应(polymerasechainreaction),是通过模拟体内DNA复制的方式,在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。
原理:PCR技术的基本原理PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍
发展:Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。1985年,美国科学家KaryMullis发明了PCR技术。1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性。Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶。此后PCR方法从一种定性的分析方法发展到定量测定;从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前成为为止,PCR技术已有十几种之多,例如反转录PCR,免疫PCR等。
应用:特定DNA序列的克隆与重组子的鉴定,DNA的体外定点突变与分析,同源重组子的检测,染色体DNA的引物原位杂交,构建基因文库,测序,基因的修饰,基因表达研究—mRNA的定量分析等。
P.CR是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR,以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因,并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。
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