化学渗透假说认为线粒体内膜中的呼吸链起着质子泵的作用。NADH和FADH2的氢原子具有高能电子，当高能电子沿呼吸链从一个复合体传递至另一个复合体时，释放的能量使质子（H+）通过呼吸链中的递氢体从线粒体内膜的基质侧传至膜间腔。因为膜对H+不能自由通透，因此在内膜两侧形成质子电化学梯度，线粒体基质侧为负（-），膜间腔为正（+）。内膜两侧质子电化学梯度的建立，能够形成质子动势，其中蕴藏了能量。泵入到膜间腔的H+依顺浓度差返回基质的趋向，当它们通过ATP酶复合体中的质子通道进入基质时，ATP酶利用质子电化学梯度的能量催化ADP与Pi合成ATP，使释放的能量以高能磷酸键的形式储存于ATP中。化学渗透假说的最大特点是强调了膜结构的完整性，如果膜不完整，H+能自由出入，则无法形成线粒体内膜两侧的质子电化学梯度，那么氧化磷酸化就会解耦联。ATP是组织细胞能够直接利用的高能化合物，当组织细胞各种生命活动需要能量时，ATP水解生成ADP和Pi并释放出能量。