最关键的一步是脱色，重点是掌握脱色时间。如果脱色过度，对于G+细菌来说，经乙醇脱色处理，细胞内的结晶紫和碘形成的紫色复合物也会随乙醇一同洗脱出去，细胞变成无色，经番红复染后菌体呈红色，鉴定为G-，出现假阴性；相反，对于G-细菌来说，如果脱色不足，会出现假阳性。

指用溶菌酶EDTA（乙二胺四乙酸）处理细胞时，可得到残留了部分细胞壁的原生质体，也叫球状体。通常由G-细菌形成。

位于细菌细胞最外面的一层厚实、坚韧的外被，主要成分为肽聚糖，具有固定细胞外形和保护细胞等多种功能。