不同的培养基其制备方法也不同，一般包括以下步骤：
（1）准确称量试剂根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需试剂必须纯净。
（2）校正pH值将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6、8～8、0的精密试纸或酸度计测定。用1NNaOH和1NHCl调节pH值到适宜范围内。
（3）过滤将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。
（4）分装将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内（试管内每支装5mL；三角瓶中装100～150ml），塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。
（5）灭菌培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。

有干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法）。

物理法：火焰、煮沸、高压蒸汽、紫外线、过滤等。化学法：强酸、强碱、消毒剂。