（1）目的片段与载体经相同的限制性内切酶或同尾酶切割，产生匹配的粘性末端，可直接进行连接。
（2）目的片段与载体经限制性内切酶切割后，产生平末端，也可直接进行连接。但是由于平末端连接效率较低，可采用下面的方法进行连接。
（3）同聚物加尾法：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA（dG）和dT（dC.，然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3’-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3’-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3’-OH端逐个添加单个核苷酸。
（4）接头连接法：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子加到载体或外源DNA的分子上，在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列，这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点，产生匹配的黏末端以便于连接。这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子。
（5）PCR接头法：设计含有限制酶切位点的引物，在PCR过程中在目的片段直接加上接头