培养菌种所用的各种培养基，在接入菌种培养前，必须进行完全彻底的灭菌处理，使各种培养基成为无菌状态，以防止生产中出现杂菌污染，确保生产的顺利进行。常用培养基的灭菌方法通常有高压蒸气灭菌法和常压（就是指无压力）蒸气灭菌法两种。
（一）高压蒸气灭菌法
将培养基按比例配好后，装入耐压的玻璃容器中，塞好棉塞，用隔水纸把棉塞包好，再置于高压蒸气灭菌锅内，关闭高压锅的盖子，不关排余水的阀门，打开进蒸气的阀门进气，当排余水阀门向外喷出蒸气时，关闭余水阀门，开始缓缓加热升压，当锅内压力上升时，再打开排余水阀门排余水一次。注意蒸气阀门不要打开过大过猛，以防容器中培养基冲出或浸湿棉塞。待压力表指针指向1.0-1.2Kg／cm²时，温度大约在100一125℃左右，这样保持20—30分钟。达到时间后，关闭供气阀门或电源，然后打开余水阀门进行缓慢的排气，当压力表指针回到0时，才可打开高压锅盖，取出培养基，这就达到了灭菌的目的。使用高压锅对培养基灭菌时，应注意那些在高压、高温下容易发生变化的培养基不宜采用，以免灭菌后菌种不能利用。高压蒸气灭菌锅有两种形式，一种是采用外来蒸气，另一种则利用自身所带电器设备对水进行加热产生蒸气，使用后一种时，应随时注意锅内的水位，防止因缺水而烧坏高压锅。高压蒸气灭菌法，具有灭菌时间短，灭菌彻底等优点。

（二）常压蒸气灭菌法
常压蒸气灭菌法，其操作方法是把已装好的各种培养基放入常压蒸气灭菌锅内，盖好盖子（盖上应装有排气阀使蒸气能不断地排出），打开进气阀门，升温至80—100℃，保持30—45分钟，以杀死培养基中各种微生物的营养细胞。灭菌到时后，取出冷却，置于30—37℃的恒温培养箱内培养24小时，使部分没有被杀死的微生物的芽胞萌发成为营养细胞，再用同样的方法处理二次（共计三次），就可杀死培养基中所有的芽胞和细胞，如此就可达到灭菌的目的。

以上两种方法对培养基的灭菌，根据生产实践，后一种方法比前一种方法好（但对某些必须采用快速、高温的培养基，则宜用前一种方法），这是因为采用高压蒸气灭菌时，由于温度、压力较高，使培养基中某些营养物质发生分解和焦化，营养成分遭到破坏，培养基中的凝固剂--琼脂的凝固性也将受到不同程度的影响，所以，菌种纯培养所用培养基最好采用常下蒸气灭菌法灭菌。例如某含糖液通过灭菌损失情况如表

另外，采用某些化学灭菌剂加入培养基中，也可起到抑制或灭菌作用。但是，抑制了其它杂菌，对生产所用菌也产生抑制和影响，故此方法在菌种纯培养阶段一般不采用。而大生产发酵中有时采用少量的化学灭菌剂，则有利于防止杂菌的污染。例如，糖蜜发酵前，往往每吨糖蜜加入300—400g的漂白粉或者加入40％的甲醛400—500ml，都利于防止糖蜜发酵时细菌的污染。