氨酰tRNA合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，通常简写为aaRS）是一类催化特定氨基酸或其前体与对应tRNA发生酯化反应而形成氨酰tRNA的酶。氨酰tRNA的酶对tRNA及其携带的氨基酸非常专一，其相应序列被称为“第二遗传密码”。在翻译过程中，每种tRNA分子都需要与相应的氨基酸结合，然后将这些氨基酸运送到核糖体进行蛋白质合成。这种结合是在一系列氨酰tRNA合成酶的作用下完成的，这些酶通过酯化反应将正确的氨基酸与对应的tRNA分子相连接。连接反应的第一步是在合成酶作用下，ATP分子和对应的氨基酸（或其前体）结合形成氨酰-AMP（腺苷酸），并释放出无机焦磷酸（PPi）。然后，酶与氨酰-AMP复合物再与正确的tRNA分子结合，催化氨基酸从氨酰-AMP转移到tRNA的3’端最后一个碱基的2’-或3’-羟基上。一些合成酶还具有校对功能以确保tRNA结合的正确性：如果tRNA被发现与错误的氨基酸相连接，那么所形成氨酰tRNA会通过水解重新被打开。
合成酶利用一种双筛机制避免产生带有错误氨基酸的tRNA。第一次筛选由酶的活化位点来完成，该位点拒绝太大的底物，而像氨基酸这样的小底物恰好能进入活化位点并活化为氨酰腺苷酸形式，有时直接形成氨酰tRNA。第二次筛选被称为校正或编辑，在编辑位点被识别为不正确的就会被降解。