脂肪酸的β氧化是脂肪酸氧化的主要方式，除脑组织外，大多数的组织均可进行，其中肝、肌肉最活跃。整个过程分为三步进行：
（1）脂肪酸活化（胞液）
脂肪酸在脂酰CoA合成酶作用下，生成脂肪酸的活化形式——脂酰CoA，这是耗能的过程。
（2）脂酰CoA进入线粒体
脂酰CoA进入线粒体进行分解，脂酰CoA分子在肉碱脂酰转移酶Ⅰ的帮助下进入线粒体，所以它是脂酸氧化的限速酶。
（3）脂肪酸的β氧化
脂酰CoA进入线粒体基质后，在脂酰基β碳原子上开始，进行脱氢、加水、再脱氢及硫解4步酶促反应，形成比原来少2个碳原子的脂酰CoA及1分子的乙酰CoA。再照此循环，直至最后完成β-氧化，形成大量乙酰CoA，进入三羧酸循环，彻底氧化生成CO2和H2O。
在整个过程中1分子软脂酸（C16）彻底氧化净生成106分子ATP，1分子硬脂酸（C18）彻底氧化分解净生成120分子ATP。